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普通PCR 梯度PCR 熒光定量PCR儀的區(qū)別及運(yùn)用

更新時(shí)間:2015-11-03      瀏覽次數(shù):4039

PCR:即合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),利用DNA在體外95時(shí)解旋(變性),55時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合(退火),再調(diào)溫度至72左右,DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈(延伸)。

PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備,能在95,55,72之間很好地進(jìn)行溫度控制。

根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)可以將PCR儀分為:普通PCR儀,梯度PCR儀,原位PCR,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等幾類

普通PCR儀:

一般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀,稱之為普通PCR儀,也就是傳統(tǒng)的PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。

   普通PCR主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、檢疫等。

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梯度PCR儀:

一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。不同的DNA片段其的退火溫度不同,通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增,從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。

    梯度PCR主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增,這樣既節(jié)約時(shí)間,也節(jié)約成本。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。梯度PCR儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu),檢驗(yàn)、檢疫等。

:啟步BSW-2T,BSW-3T,BSW-6T-I/II ,ABI 9700,ABI Veriti, Bio-Rad T100 PCR

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原位PCR儀:

PCR是提取細(xì)胞或組織中的DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng),而原位PCR是保持細(xì)胞或組織的完整性,使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中,在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA,而且還可以了解靶DNA存在于何種細(xì)胞中,更有利于探討靶DNA與細(xì)胞之間的關(guān)系。

    原位PCR,主要應(yīng)用于:(1)檢測(cè)外源性基因片段,提高檢出率,集中在病毒感染的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)觀察病原體在體內(nèi)分布規(guī)律(3)內(nèi)源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、IgmRNA片段、癌基因片段等。(4)檢測(cè)導(dǎo)入基因;(5) 遺傳病基因檢測(cè)如β-地中海貧血。 

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:

在普通PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上增加熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng),形成了具有熒光定量功能的PCR儀器。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同,在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記,使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng),得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。

   熒光定量PCR儀有單通道,雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候,選用單通道;有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物,因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量,需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多種目的基因的功能。

   熒光定量PCR主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。熒光定量檢測(cè)技術(shù)在臨床診斷方面很多,主要集中在各種病原體引起疾病的臨床診斷,如肝炎類疾病、性病、與優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)的疾病以及肺結(jié)核等等。

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